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噬菌體展示技術介紹

噬菌體是一種以細菌為宿主的病毒，由蛋白質外殼和其中包裹的DNA構成。大部分噬菌體長有“尾巴”，用來將遺傳物質注入宿主體內。整個噬菌體的長度為20～200納米。

噬菌體是通過結合細菌表面的受體來感染特定的細菌，其生長周期分為3個階段。 1）感染階段: 噬菌體的尾部附著在細菌的細胞壁上，通過溶菌酶在細胞壁上打開一個缺口，將噬菌體DNA注入細菌體內；2）增殖階段: 噬菌體DNA進入細菌后，在很短的時間內（通常幾分鐘），就會利用宿主細菌的“代謝機器”，大量地復制子代噬菌體的DNA和蛋白質，并形成完整的噬菌體顆粒；3）成熟階段: 噬菌體有“烈性”和“溫和”兩種類型。在成熟階段，烈性噬菌體會釋放溶菌酶促使細胞裂解，從而釋放出子代噬菌體；而溫和噬菌體在侵入細菌后，其核酸附著并整合在宿主染色體上，和宿主核酸同步復制，子代噬菌體成熟后并不裂解宿主細菌。

噬菌體展示技術

噬菌體展示技術由George P. Smith在1985年發明: 通過將外源基因插入絲狀噬菌體f1的PⅢ基因，使外源基因編碼的多肽與膜蛋白PⅢ形成融合蛋白，進而將外源多肽展示在噬菌體表面。之后在幾組科學家，包括英國Laboratory of Molecular Biology的 Greg Winter和John McCafferty，美國Scripps Research Institute 的Richard Lerner和 Carlos Barbas，以及德國 Cancer Research Center的FrankBreitling 和 Stefan Dübel的共同努力下，噬菌體展示蛋白庫（包括抗體庫）技術發展了起來，用于治療性蛋白Medication的篩選。其原理是將外源基因文庫插入噬菌體膜蛋白基因，然后將外源蛋白庫（包括多肽庫、小蛋白庫和抗體庫）展示在噬菌體表面。

抗體是生物Medication的重要組成，這里我們詳細介紹一下噬菌體展示抗體庫。按照構建方法的不同，抗體庫被分為3種不同的類型：天然抗體庫（na?ve antibody library），全合成抗體庫（fully synthetic antibody library）和半合成抗體庫(Semi-synthetic antibody library)。
天然抗體庫是指利用人或者動物外周血中的B細胞作為抗體庫基因的來源，制備的抗體庫。根據是否接受抗原免疫，進一步分為免疫庫和非免疫庫。人源的天然抗體庫（也叫全人源庫）是報道較多的能夠成功制備單抗的抗體庫，典型的是Cambridge Antibody Technology (CAT)的全人源庫。CAT利用PCR方法從43個健康人的外周血B細胞中擴增出抗體重鏈和輕鏈（包括kappa和Lambda）的可變區基因（VH和VL），然后將Vh和Vl通過linker連接成單鏈抗體(scFv)并克隆至噬菌粒，感染大腸桿菌獲得抗體庫。由CAT全人源抗體庫篩選得到的阿達木單抗（adalimumab ，Humira），被用于治療自身免疫性疾病。該單抗Medication在2016年的全球銷售額達到160億美元。
全合成抗體庫是指用于構建抗體庫的重鏈和輕鏈的可變區基因都來源于體外合成：首先選定代表性的抗體基因作為模板，然后利用分子生物學的技術在互補決定區（CDRs）引入高通量突變，從而形成多樣性很高的抗體庫。具代表的是Morphosys 公司的HuCAL（Human Combinatorial Antibody Library）和Genentech的抗體庫。HuCAL在構建時選定了7個重鏈可變區框架（VH1A，VH1B， VH2，VH3，VH4，VH5，VH6）和7個輕鏈可變區框架（VK1，VK2，VK3， VK4， VL1， VL2， VL3），分別在其CDRs引入突變，然后將重鏈和輕鏈進行組合構建了49種不同的單鏈抗體庫(scFv)。在2007年和2011年，Morphosys 分別公布了第二代HuCAL庫（HuCAL GOLD）和第三代HuCAL庫（HuCAL PLATINUM），通過在模板基因、展示技巧、抗體庫多樣性方面進行了優化，提高了抗體庫的庫容、篩選成功率、以及抗體在哺乳動物細胞上的表達。Genentech全合成庫的設計思路與MorphoSys不同，Genentech僅采用了單一抗體基因為模板，通過在多個CDRs區域極限突變，形成庫容量和多樣性都非常高的抗體庫。
半合成抗體庫是指在構建抗體庫時，所使用的抗體基因有一部分是來源于合成的基因片段，而其它部分來源于天然的抗體基因。比較典型的兩個半合成抗體庫來自于BioInvent和Dyax。BioInvent抗體庫利用固定的輕鏈和重鏈（分別為VL-DPL3和VH-DP47）為模板，在CDRs區引入天然的CDRs。 Dyax抗體庫的輕鏈部分完全來自于天然抗體（正常人外周血B細胞）；重鏈選擇了單一的重鏈基因VH3-23（DP47）為模板，在CDR H1和H2中引入設計的突變，在H3區引入了天然的抗體基因片段。

在利用噬菌體展示抗體庫技術獲得的單抗Medication中，有7個成功上市，包括年銷售額排名第1的Humira（阿達木單抗，修美樂），2016年全球銷售額為160億美元。另外有57個利用噬菌體展示抗體庫技術獲得的單抗Medication處于臨床1期到3期階段。

表：噬菌體展示抗體庫技術來源單抗的市場情況

抗體名稱	資助公司	靶點	技術來源	上市時間	適應癥	2016銷售額 (億美元)
Adalimumab (Humira)	Abbott Lab	TNFα	CAT	2002	類風濕性關節炎，幼年特發性關節炎等	160
Ranibizumab (Lucentis)	Genentech	VEGFA	Genentech	2006	老年性黃斑變性	26
Romiplostim (Nplate)	Amgen	血小板生成素受體	Affymax	2008	免疫性血小板減少性紫癜	-
Belimumab (Benlysta)	GSK	B淋巴細胞刺激因子	CAT	2011	全身性紅斑狼瘡	2.43
Raxibacumab (Abthrax)	CAT 和GSK	炭疽保護性抗原復合物(PA)	CAT	2012	炭疽的預防和治療	-
Ramucirumab （Cyramza）	Imclone和Lily	VEGFR2	Dyax	2014	胃癌、結直腸癌、非小細胞肺癌	4.37
Necitumumab （Portrazza）	Imclone 和Lily	EGFR	Dyax	2015	鱗狀非小細胞肺癌	0.11

臨床階段	Phase 1	Phase 1/2	Phase 2	Phase 2/3	Phase 3
單抗數目	14	4	28	2	9